2023.07.20: Co-cultivo de neuronas DRG i células de Schwann (rata)

Día anterior: Coating placas para co-cultivos y neuronas

• Coating con Poly-D-lys 1/40 : incubar overnight a 37ºC
• Día siguiente: lavar pozos y hacer coating con Laminina 2’5 ul/ml : incubar mínimo 1h a 37ºC
  • Explantes DRG:  1 placa de 24 wells con 1 cubre de 12mm en cada pozo, y 6 culture slides
  • Neuronas DRG: 4 placas 100 cc (para IP) y 1 placa 60 cc con 26 cubres 9mm
  • Neuronas médula: 2 placas 60 cc con 26 cubres 9mm à una placa la hago con sólo neuronas (tratadas como neuronas DRG), y otra con todas las células (tratadas como co-cultivos)

*Hago una prueba haciendo coating overnight con Matrigel 1/20

• Explantes DRG:  1 placa de 24 wells con 1 cubre de 12mm en cada pozo à hago 12w con DRG disgregadas, y 12w con explantes

Co-cultivo de neuronas DRG i células de Schwann (rata)

Se extraen a partir de embriones de rata. Ratas Sprague-Dawley embarazadas.

Se piden ratas E15 pero se utilizan pasadas 24horas : el cultivo se inicia en E16.

Extracción de DRGs

• Estabulario
• Llevar al estabulario un tubo falcon de 50 ml con medio L15 (en hielo) y material instrumental (tijeras, bisturí, pinzas…).
  • Medio L15:
    • 45 ml de medio Leibovitz’s
    • 5 ml de FBS (10%)

• Poner el animal a la cámara de CO₂ : abrir la llave hasta el número 2, subir el O₂ hasta el 2, y poner el  isofluorano al 5.
• Sacar la rata de la cámara y ponerla encima de un corcho. Pinchar 1ml de TP41 (Solución inyectable para eutanasia) en el corazón.
• Mojar la rata con alcohol y abrir por debajo (ponerla boca arriba). Tirar de las bolsas de los fetos y ponerlos en una placa con L15.
• Sacar todos los fetos de las bolsas y ponerlos en un tubo con medio L15 (en hielo).
• Cultivos
• Poner todos los fetos en una placa con el medio L15 y mantenerla sobre el hielo.
• Coger un feto, ponerlo sobre la placa con Agar y mojarlo con PBS (estéril y frío, mantenerlo en hielo). Es importante ir mojando el feto con PBS, no puede quedarse seco en ningún momento.
• Cortar la cabeza con unas tijeras y clavar el feto boca abajo con 4 puntas de aguja en las extremidades.
• Sacar las dos capas que envuelven la medula espinal y sacar la médula procurando que no se rompa.
• Sacar los ganglios que se hayan quedado pegados a la médula y pasarlos a una placa pequeña con L15.
• Con una aguja de insulina sacar para fuera los DRG de la columna e irlos pasando a la placa con L15

Co-cultivos (explantes DRG)

• D0 : Añadir 400 ul de medio C (co-culture medium) a cada pozo con cubre:
  • Medio C (co-culture medium):
    • DMEM (con D-glucosa y Glutamax): 44,5 ml (ref. 10569-010 ThermoFisher)
    • 10% FBS: 5 ml
    • 1% Pen-Str: 0,5ml
    • 50 ng/ml NGF: 25 ul
• Poner un DRG o trocito de médula en cada pozo/cubre e incubar a 37ºC

Neuronas DRG

• Pasar los DRG a un tubo de 15 ml: con pipeta Pasteur de cristal y tetina
• Centrifugar a 300 rpm 5 min
• Eliminar el sobrenadante (con pasteur cristal+ tetina) e ir tirando a una placa, para no perder ningún DRG.
• Poner 5 ml de PBS1x y centrifugar a 300 rpm 5 min
• Eliminar el sobrenadante y añadir 4,5 ml PBS + 500 ul de tirpsina 2,5% sin bromophenol
• Incubar 15min a 37ºC (en el baño). Homogeneizar suavemente cada 5 minutos.
• Añadir 5 ml de medio L15 con FBS para inactivar la tripsina
• Centrifugar a 300 rpm 10min
• Pasar el pellet a un eppendorf con 1 ml de medio NG, disgregar con pipetas Pasteur de vidrio finas (se hacen finas con el bunsen y se autoclavan).

Medio NG:

• 48 ml de medio Neurobasal
• 1 ml de suplement B27
• 500 µl de glutamax
• 500 µl de Pen-Str
• 25 µl de NGF
• Dividir el ml de células entre las 4 placas de 100 cc, la placa de 60cc con cubres, y los 12w que usaré para co-cultivos disgregados.

*Guardo en  MACS Tissue  Storage Solution (130-100-008, Milteny) las médulas de 4 embriones y las dejo en 4ºC hasta el día siguente.