Seguir protocolo 1. HiTrap Desalting columnsM (Usamos Buffer dH2o con cloruro de sodio 100mM) + 2. IgM purification HiTrap columns
Usamos 1,3mL de suero de paciente IMAGINE 20 (20mg/ml concentración de proteinas totales)
Después de la purificación según el protocolo del kit de columnas, obtenemos 12mL de Eluido, que centrifugamos en tubos de Amicon – Ultra 15 (UFC900324 Milipore)
Primero centrifugamos el tubo con 15mL de de PBS filtrado a 4500 rpm x 10 minutos a 4ºC
Decantar
Después introducimos 12mL de eluido y centrifugamos durante 20 mintuos a 4500rpm
Según que volumen tengamos, centrifugamos 20 min extra
Recoger el contenido en la cesta y con ese volumen limpiar el filtro
Después vamos al nanodrop para estimar la concentracción de IgM
Medimos concentración de IgM –> resultado: 0,217 mg/ml –> multiplicar por 1,25 (coeficiente extición molar de IgM) –> el resutado es 0,27 mg/ml
Comprobamos el marcaje en nervio de mono
Muestras: 1. muestra original 1/10 (IgG), 2. muestra original 1/10 (IgM), 3. Muestra IgM purificada 1/10 (IgG), 4. muestra IgM purificada 1/10 (IgM). 5. muestra desalada
RESULTADOS
1. muestra original 1/10 (IgG), –> NEGATIVO
2. muestra original 1/10 (IgM), –> POSITIVO MIELINA MAG
3. Muestra IgM purificada 1/10 (IgG), –> NEGATIVO
4. muestra IgM purificada 1/10 (IgM). –> NEGATIVO
5. muestra desalada –> POSITIVO MIELINA MAG
INTERPRETACIÓN –>la muestra purificada no tiene IgM
