2023.03.12 ICC co-cultivos (día 38.2 – rata 02.02.2023)

Uso 22 cubres de las placas con medio de mielinización 2:

Muestras:

1. CIDP15 (GDP1, LIF+)
2. CIDP15 (GDP1, LIF+)
3. 151-21 (GDP2)
4. 151-21 (GDP2)
5. CIDP78 (MRVM 1ª muestra , LIF+ CASPR1+)
6. CIDP78 (MRVM 1ª muestra 21/11/11 , LIF+ CASPR1+)
7. 179-06 (MRVM 26/08/15)
8. 179-06 (MRVM 26/08/15)
9. 22-3-414 Box 295 (Bocanegra 1ª muestra Plasma, CASPR1+)
10. 23-234205 (Bocanegra 20/02/23 CASPR1neg)
11. CIDP16 (JCDHM, NF155+)
12. CIDP18 (ESG, NF155+)
13. CIDP21 (RDP, panNF+)
14. CIDP44 (TMF, CNTN1+)
15. Cneg 21-2-1608
16. Cneg 204-10
17. Cneg 204-11
18. CIDP50 (JMG, NF155+)
19. 21-2-94 (X4069 CNTN1+)
20. CIDP80 (JMSM, NF155+)
21. Triple ICC: NFh (antiguo), MBP, CASPR1 (caspr1 en vivo overnight 1/100)
22. Tripe ICC: neurofilament200(nuevo), MBP, panNF (panNF en vivo overnight 1/100)

Protocolo:

• Incubar con suero 1/100 en medio de mielinización 1 : 48h  37ºC
• 1 lavado con PBS1x
• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear 30 min con Goat serum 5% tritón 1%
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% tritón 0’5% (1h RT)
  • MBP anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse)
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% tritón 0’5%(todos a 1/500)
  • 1-20 : GAH488 IgG (suero) + GAM594 (MBP)
  • 21 : GAM488 (MBP) + GAR594 (Caspr1)
  • 22 : GAM488 (MBP) + GAC594 (panNF)
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Resultado: ha salido bien el MBP, aunque es raro que en algunos cubres hay mucha mielina y en otros no hay

1. CIDP15 (GDP1, LIF+): no hay mielina
2. CIDP15 (GDP1, LIF+): no hay mielina
3. 151-21 (GDP2): negativo
4. 151-21 (GDP2): negativo
5. CIDP78 (MRVM 1ª muestra , LIF+ CASPR1+): no hay mielina
6. CIDP78 (MRVM 1ª muestra 21/11/11 , LIF+ CASPR1+): no hay mielina
7. 179-06 (MRVM 26/08/15): negativo
8. 179-06 (MRVM 26/08/15): negativo
9. 22-3-414 Box 295 (Bocanegra 1ª muestra Plasma, CASPR1+): no hay mielina
10. 23-234205 (Bocanegra 20/02/23 CASPR1neg): parece contaminada. No hay mielina
11. CIDP16 (JCDHM, NF155+): + mielina, + axones
12. CIDP18 (ESG, NF155+): + mielina, + axones
13. CIDP21 (RDP, panNF+): parece contaminada
14. CIDP44 (TMF, CNTN1+): ++ axones, + paranodo??
15. Cneg 21-2-1608: no hay mielina
16. Cneg 204-10: negativo
17. Cneg 204-11: parece contaminada
18. CIDP50 (JMG, NF155+) : no hay mielina
19. 21-2-94 (X4069 CNTN1+): no hay células
20. CIDP80 (JMSM, NF155+): no hay células
21. Triple ICC: NFh (antiguo), MBP, CASPR1 (caspr1 en vivo overnight 1/100): no se ve el Caspr1. No hacer en vivo
22. Tripe ICC: neurofilament200(nuevo), MBP, panNF (panNF en vivo overnight 1/100): no se ven los paranodos y se marcan todos los axones. No hacer en vivo