Obvjetivo: comprovar la transfección de LGI4 / ADAM22. Tenemos 2 portas transfectados solo con LGI4; solo con ADAM22; cotransfectados con LGI4 + ADAM22. Uno lo permeabilizaremos y otro no.
Protocolo:
- Permeabilizar con tritón 0.3% en PBS 5 minutos 1 porta, el otro sin permeabilizar
- 1 lavado PBS1x
- Bloquear con goat serum 5% 1h
- Incubar 1h con anticuerpos primarios diluidos en goat serum 5%
- LGI4: anti-LGI4, ab173297 (abcam). Dil 1/100 (rabbit) –> 2 pozos cotransfectados; 2 pozos solo LGI4, dos pozos solo ADAM22
- Anti-ADAM22 (invitrogen PA5-65610), dil 1/100 (Rabbit)–> 2 pozos cotransfectados; 2 pozos solo LGI4, dos pozos solo ADAM22
- 3 lavados con PBS1x
- Incubar 1h con Ac secundario diluido GAR 488 IgG 1/500
- 3 lavados con PBS 1x
- Montar con Fluoromount
Resultados: el ADAM22 se trasnfecta bien. Se ve tanto en los pozos cotrasnfectados como en los transfectados únicamente con ADAM22. Se ve también permeabilizando y sin permeabilizar.
El LGI4 se ve intracelular en los cotransfectados y un poco peor en los transfectados únicamente con LGI4. Solo se ve permeabilizando. Cambiaremos el anticuerpo primario del LGI4 a ver si se ve mejor y sin permeabilizar.
Permeabilizado – cotrasnfección LGI4 + ADAM22, anticuerpo primario LGI4
Permeabilizado- cotrasnfección LGI4 + ADAM22, anticuerpo primario ADAM22
Permeabilizado- transfección LGI4, anticuerpo primario LGI4
Permeabilizado- transfección ADAM22, anticuerpo primario ADAM22
No permeabilizado – cotrasnfección LGI4 + ADAM22, anticuerpo primario LGI4
No permeabilizado- cotrasnfección LGI4 + ADAM22, anticuerpo primario ADAM22
No permeabilizado- transfección LGI4, anticuerpo primario LGI4
No permeabilizado- transfección ADAM22, anticuerpo primario ADAM22
