2023.01.09: ICC co-cultivos (día 26 – rata 15/12/2022)

Cojo 2 cubres de los co-cultivos para ir viendo cómo va la diferenciación.

Protocolo:

• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear con Goat serum 5% y 0’5% tritón (en PBS): 1h a RT
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón  (en PBS): overnight 4ºC
  • MBP y NFh
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/500 (mouse) : overnight 4ºC
    • anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken) : 1h RT
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (todos a 1/750)
  • MBP y NFh: GAM594 + GAC488
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Resultado: Igual que día 19 NFh se ve muy bien. Todavía no hay mielina (no marca nada el MBP) : quizás no se formará mielina porque me parece que las cels de Schwann no están bien alineadas.

Hacer con explantes a partir de ahora!!