PROTOCOL: B cells study (culture, stimulation, treatment, fenotyping) 8 days

EXTRACCIÓ DE PBMCs

1. Extreure 4-5 tubs CPT. Centrifugar 20 minuts a 1650 g sense fre a temperatura ambient.
2. Invertir els tubs per resuspendre les cèl·lules al plasma i decantar els sobrenadants a un tub de 50 ml.
3. Rentar amb suero fisiològic en una proporció 1:1 i centrifugar durant 5 minuts a 300g amb acceleració i fre.
4. Treure el sobrenedant i fer un altre rentat amb suero fisiològic (posar 40 ml de suero).
5. Centrifugar 5 minuts a 300 g amb acceleració i fre, i treure el sobrenedant.
6. Ressuspendre el pellet en 2 ml de B cell isolation medium
   • 2% de FBS: 500 µl
   • 1 mM d’EDTA: 50 µl de EDTA 0’5M
   • 24’5 ml de PBS
7. Fer recompte cel·lular (manual).

* Si és necessari, les cèl·lules es poden congelar:

• Centrifugar 5 minuts a 300 g i treure el sobrenedant.
• Ressuspendre en medi de congelació (FBS + DMSO 10 %): passar a criotub i congelar amb cryofreezer.

SEPARACIÓ DE CÈL·LULES B

S’utilitza el kit “EasySep negative selection Human B-cell enrichment kit” (190549, Stemcell Technologies).

1. Preparar la suspensió cel·lular a una concentració de 5×10⁷ cèls/ml (en Bcell isolation medium): les cèl·lules s’han de posar a un tub de 5 ml de polyestirene (tap de doble tancament).
   1. Tenir en compte que la suspensió no pot tenir menys de 500 µl ni més de 2 mL. Per concentrar les cèl·lules, centrifugar a 300 g durant 5 minuts.
2. Afegir 75 µl de Human B Cell Enrichment Cocktail cada ml de suspensió cel·lular. Barrejar bé i incubar a temperatura ambient durant 10 minuts.
3. Afegir 75 µl de D Magnetic Particles cada ml de suspensió cel·lular. Barrejar bé i incubar a temperatura ambient durant 5 minuts.
4. Afegir Bcell isolation medium fins a un volum total de 2,5 ml.
5. Posar el tub (sense tap) dins de l’imant lila. Deixar 5 minuts.
6. Invertir l’imant (in one continous motion) i passar el contingut del tub a un altre tub de 5 ml amb doble tancament
7. Fer recompte cel·lular i agafar cèls per fer citometria

CULTIU I ESTIMULACIÓ DE CÈLS B

Cultivar les cèls a una densitat de 2’5×10⁶ cèls/ml

Medi de cultiu de cèl·lules B (25 ml totals):

• 24,5 ml de RPMI
• 1 % de Penicil·lina-Streptomicina: 250 µl
• 1 % de L-glutamina: 250 µl

1. DIA 0: centrifugar les cèls 5 mins a 300g i resuspendre-les en medi de cultiu de cèls B + 3 µg/ml de CpG-B + 10 µg/ml de GAH IgA+IgG+IgM.
   1. CpG-B 2006: concentració solució stock 500 µM o 3,85 µg/µl –> es fan alíquotes de 5 µl i es congelen a -20ºC.
   1. GAH IgA+IgG+IgM: està a la nevera a una concentració de 2’4 mg/mL.
2. Les cèl·lules s’han de separar en dues condicions (dos tubs de 5ml): Tractades amb BSA, i tractades amb IVIg
3. Deixar les cèl·lules en cultiu (als dos tubs) durant 24 hores (37ºC, 5 % CO₂)

TRACTAMENT DE CÈL·LULES B

1. 24 després (DIA 1): preparar els medis que s’utilitzaran en cada condició:
   • Medi BSA: preparar una solució de BSA 40 mg/ml en medi de cultiu de cèls B –> 2,083 g BSA + 50 ml RPMI + 0’5 ml Pen-Str + 0’5 ml glut
   • Medi IVIg:
     • dialitzar IVIg en medi de cultiu de cèls B: utilitzant Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes (Thermo Fisher).
       • Preparar 500 ml de medi de cultiu de cèls B. Posar 250 ml a un vas de precipitats
       • Hidratar el casset de diàlisis durant 1-2 minuts (introduir al medi amb el flotador)
       • Posar 3 ml de IVIg 100 mg/ml al casset (xeringa + agulla a una de les cantonades)
       • Treure l’aire del casset (pujant el pistó de la xeringa)
       • Posar el casset al vas de precipitats amb medi (amb el flotador)
       • Deixar 2 hores en agitació a RT (tapar)
       • Canviar tot el medi del vas de precipitats i deixar overnight a 4ºC (sense agitar, tapat)
       • Al dia següent: omplir la xeringa amb aire i injectar a una cantonada diferent del casset. Girar el casset i recollir la solució IVIg dialitzada (estarà a 100 mg/ml)
     • Diluir la solució d’IVIg dialitzada de 100 mg/ml a 40 mg/ml: 3 ml de solució dialitzada en 4,5 ml de medi de cèls B.
2. Centrifugar les cèl·lules i afegir a cada tub (un per cada condició):
   • Medi BSA: 20 mg/ml (és a dir, diluir 1:1 el medi BSA amb medi de cèls B) + CpG 3 µg/ml + anti-Igs 10 µg/ml
   • Medi IVIg: 20 mg/ml (és a dir, diluir 1:1 el medi IVIg amb medi de cèls B) + CpG 3 µg/ml + anti-Igs 10 µg/ml
3. Cultivar 24 hores a 37ºC, 5 % CO₂
4. 24 hores més tard (a les 48h, DIA 2) agafar 100 µl de cada tub i fer citometria. Afegir nou medi (20 mg/ml) a cada tub segons correspongui.
5. 72 hores més tard (a les 96h, DIA 5) agafar 100 µl de cada tub i fer citometria. En aquest moment canviar el tractament: les cèls tractades amb BSA passaran a estar tractades amb IVIg, i viceversa.
   • Les cèls tractades amb BSA fins ara es separen en dos tubs: els dos es centrifuguen i un es resuspèn en medi BSA (control de no-canvi de tractament) i l’altre es resuspèn en medi IVIg.
   • Les cèls tractades amb IVIg fins ara es separen en dos tubs: els dos es centrifuguen i un es resuspèn en medi IVIg (control de no-canvi de tractament) i l’altre es resuspèn en medi BSA.
6. 48 hores més tard (DIA 7) es torna a fer citometria.

CITOMETRIA

Si es vol fer qPCR –> agafar una part de les cèl·lules dels dos tubs i passar-les a dos microtubs RNAsa free (125.000 – 250.000 cels). Centrifugar 5 minuts a 400 g a 4ºC i congelar a -80ºC.

1. Als 100 µl de cada mostra afegir 100 µl de medi i separar en dos tubs diferents.
2. Tub 1: Incubar 100 µl de cada mostra amb la mix d’anticossos durant 15 minuts a temperatura ambient (tapat de la llum).
   1. 5 µl CD19-PC5
   1. 2 µl CD27-PC7
   1. 20 µl CD38-PE
   1. 2 µl CD24-Viogreen
   1. 2 µl IgD-FITC
   1. 5 µl Vivid-Vioblue
3. Tub 2 (IL10):
   1. Afegir 10 µl de IL-10 Catch Reagent als 100 µl de cada mostra. Incubar 5 minuts en gel
   1. Afegir 1 ml de medi de cèls B (atemperat)
   1. Incubar 45 minuts a 37ºC en agitació
   1. Posar el tub en gel i afegir 1 ml de Buffer IL10 (50 ml de PBS + 200 µl EDTA 0,5M + 0,25g BSA)
   1. Centrifugar 10 minuts a 400g a 4ºC
   1. Treure el sobrenedant i afegir 100 µl de buffer IL10
   1. Incubar amb la mix d’anticossos durant 15 minuts en gel (tapat de la llum)
      1. 5 µl CD19 – PC5
      1. 10 µl IL10 – PE
      1. 5 µl Vivid -Vioblue
4. Afegir 1 ml de PBS a cada tub i centrifugar (5 mins a 400 g a 4ºC)
5. Eliminar sobrenedant i resuspendre amb 100 µl de PBS + 100 µl de PFA 4 %
6. Analitzar amb el citòmetre