Sample: Control 1 (Esther Fernández)
EXTRACCIÓ DE PBMCs
- Extreure 6 tubs CPT. Centrifugar 20 minuts a 1650 g sense fre a temperatura ambient.
- Invertir els tubs per resuspendre les cèl·lules al plasma i decantar els sobrenadants a un tub de 50 ml.
- Rentar amb suero fisiològic en una proporció 1:1 i centrifugar durant 5 minuts a 300g amb acceleració i fre.
- Treure el sobrenedant i fer un altre rentat amb suero fisiològic (posar 40 ml de suero).
- Centrifugar 5 minuts a 300 g amb acceleració i fre, i treure el sobrenedant.
- Ressuspendre el pellet en 2 ml de B cell isolation medium
- 2% de FBS: 500 µl
- 1 mM d’EDTA: 50 µl de EDTA 0’5M
- 24’5 ml de PBS
- Fer recompte cel·lular (manual): >100 milions PBMC
SEPARACIÓ DE CÈL·LULES B
S’utilitza el kit “EasySep negative selection Human B-cell enrichment kit” (190549, Stemcell Technologies).
- Preparar la suspensió cel·lular a una concentració de 5×107 cèls/ml (en Bcell isolation medium) –> 2 ml
- Afegir 75 µl de Human B Cell Enrichment Cocktail cada ml de suspensió cel·lular. Barrejar bé i incubar a temperatura ambient durant 10 minuts. –> 150 µl
- Afegir 75 µl de D Magnetic Particles cada ml de suspensió cel·lular. Barrejar bé i incubar a temperatura ambient durant 5 minuts. –> 150 µl
- Afegir Bcell isolation medium fins a un volum total de 2,5 ml.
- Posar el tub (sense tap) dins de l’imant lila. Deixar 5 minuts.
- Invertir l’imant (in one continous motion) i passar el contingut del tub a un altre tub de 5 ml amb doble tancament
- Fer recompte cel·lular: 2’5×106 cèls
CULTIU I ESTIMULACIÓ DE CÈLS B
Cultivar les cèls a una densitat de 2’5×106 cèls/ml –> 1 ml: i agafo 200 µl de cèls per fer citometria (Resultats al final)
Medi de cultiu de cèl·lules B (25 ml totals):
- 24,5 ml de RPMI
- 1 % de Penicil·lina-Streptomicina: 250 µl
- 1 % de L-glutamina: 250 µl
- DIA 0: centrifugar les cèls 5 mins a 300g i resuspendre-les en medi de cultiu de cèls B + 3 µg/ml de CpG-B + 10 µg/ml de GAH IgA+IgG+IgM.
- CpG-B 2006: 0,62 µl
- GAH IgA+IgG+IgM: 3,3 µl
- Les cèl·lules s’han de separar en dues condicions (dos tubs de 5ml): Tractades amb BSA, i tractades amb IVIg
- Deixar les cèl·lules en cultiu (als dos tubs) durant 24 hores (37ºC, 5 % CO2)
TRACTAMENT DE CÈL·LULES B
- 24 després (DIA 1): preparar els medis que s’utilitzaran en cada condició:
- Medi BSA: preparar una solució de BSA 40 mg/ml en medi de cultiu de cèls B –> 2,083 g BSA + 49 ml RPMI + 0’5 ml Pen-Str + 0’5 ml glut
- Medi IVIg:
- dialitzar IVIg en medi de cultiu de cèls B: utilitzant Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes (Thermo Fisher).
- Preparar 500 ml de medi de cultiu de cèls B. Posar 250 ml a un vas de precipitats
- Hidratar el casset de diàlisis durant 1-2 minuts (introduir al medi amb el flotador)
- Posar 3 ml de IVIg 100 mg/ml al casset (xeringa + agulla a una de les cantonades)
- Treure l’aire del casset (pujant el pistó de la xeringa)
- Posar el casset al vas de precipitats amb medi (amb el flotador)
- Deixar 2 hores en agitació a RT (tapar)
- Canviar tot el medi del vas de precipitats i deixar overnight a 4ºC (sense agitar, tapat)
- Al dia següent: omplir la xeringa amb aire i injectar a una cantonada diferent del casset. Girar el casset i recollir la solució IVIg dialitzada (estarà a 100 mg/ml)
- Diluir la solució d’IVIg dialitzada de 100 mg/ml a 40 mg/ml: 3 ml de solució dialitzada en 4,5 ml de medi de cèls B.
- dialitzar IVIg en medi de cultiu de cèls B: utilitzant Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes (Thermo Fisher).
- Centrifugar les cèl·lules i afegir a cada tub (un per cada condició):
- Medi BSA: 20 mg/ml + CpG 3 µg/ml + anti-Igs 10 µg/ml –> 200 µl BSA 40 mg/ml + 200 µl medi cèls B + 0,3 µl CpG + 1,7 µl anti-Igs
- Medi IVIg: 20 mg/ml + CpG 3 µg/ml + anti-Igs 10 µg/ml –> 200 µl IVIg 40 mg/ml + 200 µl medi cèls B + 0,3 µl CpG + 1,7 µl anti-Igs
- Cultivar 24 hores a 37ºC, 5 % CO2
- 24 hores més tard (a les 48h, DIA 2) agafar 100 µl de cada tub i fer citometria (Resultats al final). Afegir nou medi (20 mg/ml + estímul) a cada tub segons correspongui.
- 72 hores més tard (a les 96h, DIA 5) agafar 100 µl de cada tub i fer citometria (Resultats al final). En aquest moment canviar el tractament: les cèls tractades amb BSA passaran a estar tractades amb IVIg, i viceversa.
- Les cèls tractades amb BSA fins ara es separen en dos tubs: els dos es centrifuguen i un es resuspèn en medi BSA (control de no-canvi de tractament) i l’altre es resuspèn en medi IVIg.
- Les cèls tractades amb IVIg fins ara es separen en dos tubs: els dos es centrifuguen i un es resuspèn en medi IVIg (control de no-canvi de tractament) i l’altre es resuspèn en medi BSA.
- 48 hores més tard (DIA 8) es torna a fer citometria (Resultats al final)
CITOMETRIA
- Als 100 µl de cada mostra afegir 100 µl de medi i separar en dos tubs diferents (excepte si directament s’han agafat 200 µl de cèls)
- Tub 1: Incubar 100 µl de cada mostra amb la mix d’anticossos durant 15 minuts a temperatura ambient (tapat de la llum).
- 5 µl CD19-PC5
- 2 µl CD27-PC7
- 20 µl CD38-PE
- 2 µl CD24-Viogreen
- 2 µl IgD-FITC
- 5 µl Vivid-Vioblue
- Tub 2 (IL10):
- Afegir 10 µl de IL-10 Catch Reagent als 100 µl de cada mostra. Incubar 5 minuts en gel
- Afegir 1 ml de medi de cèls B (atemperat)
- Incubar 45 minuts a 37ºC en agitació
- Posar el tub en gel i afegir 1 ml de Buffer IL10 (50 ml de PBS + 200 µl EDTA 0,5M + 0,25g BSA)
- Centrifugar 10 minuts a 400g a 4ºC
- Treure el sobrenedant i afegir 100 µl de buffer IL10
- Incubar amb la mix d’anticossos durant 15 minuts en gel (tapat de la llum)
- 5 µl CD19 – PC5
- 10 µl IL10 – PE
- 5 µl Vivid -Vioblue
- Afegir 1 ml de PBS a cada tub i centrifugar (5 mins a 400 g a 4ºC)
- Eliminar sobrenedant i resuspendre amb 100 µl de PBS + 100 µl de PFA 4 %
- Analitzar amb el citòmetre
RESULTATS: