20181016-20181018: HEK293 CNTN1 IP (Agarose vs Magnetic beads) GEL

Objetivo: provar con HEKs un nuevo método de IP (Pierce Magnetic IP kit) y compararlo con el método usado hasta ahora (Agarosa)

Diseño experimento: se harán 3 condiciones por cada método (se harán los dos métodos en paralelo)

• 4 placas –> HEK transfectadas con CNTN1 y tratadas con suero CNTN1 +
• 4 placas –> HEK transfectadas con CNTN1 y tratadas con suero CNTN1 –
• 2 placas –> HEK no transfectadas y tratadas con suero CNTN1+

15.10.2018: Coating HEK293

• Se preparan 20 placas de 100 mm –> coating con Poly-D-lisina 1/40 en Borate Buffer (1h a 37ºC) *En una de las placas se ponen dos cubreobjetos para comprovar la transfección.
• Se siembran 3 millones de cels/placa

16.10.2018: Transfección CNTN1

• Se transfectan 16 placas
• Por cada placa –> (13’4 µg DNA + 450 µl Optimem) + (20 µl lipofectamina + 450 µl Optimem)
  • [CNTN1] = 1’311 µg/µl 
    • 160 µl DNA + 7 ml Optimem
    • 320 µl lipofectamina + 7 ml Optimem
• Se incuba por separado durante 5 minutos a Tambiente y después se mezcla el DNA+lipo y se incuba 30 minutos a Tambiente
  
• Poner 0’9 ml de la mezcla a cada placa

17.10.2018: IP

Protocolo Agarosa

• Incubar el cultivo celular con el suero del paciente a analizar 1h a 37ºC (en el incubador). La dilución se hace en el propio medio de cultivo:
  • Para IgG: 1/100 –> 30 µl de suero en 3 ml de medio
    

*La dilución se hace en la misma placa de cultivo (sacar el medio hasta dejar 3 ml por placa, y poner el suero)

• Cuando queden 5 min, preparar la mezcla Buffer de lisis  + inhibidores de proteasas. 
• Lavar las placas 2 veces con PBS atemperado, vaciar y añadir 800 µl de buffer lisis + inhibidores de  proteasas  a cada placa. Dejar en agitación fuerte (fijadas con cinta)  durante 1h a 4ºC.
• En este intervalo de tiempo, hacer el lavado de la proteína A+G (INVITROGEN Cat:15920-010. y cat:15918-014). Preparar la Proteína A+G:
  • Resuspender las bolas con agitación manual (no vórtex ni inversión.
  • En un eppendorf por cada suero a analizar, añadir con punta de pipeta cortada 50 µl de proteína G + 50 µl de proteína A + 800 µl de buffer lisis
  • Lavar 2 veces con Buffer de lisis centrifugando a 1000 rpm 5min. a 4ºC. Repetir un último lavado adicional añadiendo inhibidores de proteasas en el último lavado (del BL+IP sobrante del paso 2).
• Pasar el scraper a cada una de las placas y recoger todo el volumen y restos celulares en un eppendorf por placa.
• Centrifugar 5 min a velocidad máxima a 4ºC.
• Pasar el sobrenadante de todos los eppendorfs a un tubo de 15ml. Añadir 500 µl de buffer lisis con las bolas de proteína A+G sin pipetear arriba y abajo.
• Dejar O/N en rotación a 4ºC tapando el tubo con Parafilm.
• Al dia siguiente:
  • Centrifugar el tubo de 15ml que dejamos en rotación  con la proteína A+G a 3000 rpm 5 min a 4ºC.
  • Descartar el sobrenadante y pasar el pellet con punta cortada a un eppendorf.
  • Lavar el pellet 2 veces con 1 mL de lisis buffer. Centrifugar a 3000 rpm 5min a 4ºC después de cada lavado.
  • Mientras preparar mezcla Laemmli + B-mercapto: 950 µL Laemmli+ 50 µL de B-mercapto
  • Descartar sobrenadante y añadir al pellet 40 µl de Laemmli + Mercapto. Homogeneizar dando suaves golpes al eppendorf. Dejar 5 min a Tºambiente
  • Calentar a 100ºC 5min (en el baño seco). Al acabar, atemperar la muestra 2 min a temperatura ambiente.
  • Realizar el gel de acrilamida

Protocolo Pierce Magnetic IP Kit

• Incubar el cultivo con el suero del paciente a analizar 1h a 37ºC (en el incubador). La dilución se hace en el propio medio de cultivo (en la placa)
  • Para IgG: 1/100 –> 30 µl de suero en 3 ml de medio

*La dilución se hace en la misma placa de cultivo (sacar el medio hasta dejar 3 ml por placa, y poner el suero)

• Lavar placas 1 vez con PBS 1x
• Añadir 800 µl de IP Lysis/Wash buffer + inhibidores de proteasas a cada placa. Dejar en agitación fuerte (fijadas con cinta)  durante 5 min a 4ºC.
  
• Transferir el lisado a un eppendorf de 2 ml (en cada eppendorf de 2 ml cabe el lisado de dos placas) y centrifugar 10 minutos a 13000 g
• Poner 25 µl de Pierce Protein A/G Magnetic Beads a cada eppendorf
• Añadir 175 µl de IP Lysis/Wash Buffer y hacer vórtex (suave)
• Poner el tubo en el soporte magnético. Eliminar el sobrenadante (sin retirar el eppendorf)
• Añadir 1 ml de IP Lysis/Wash Buffer y hacer vórtex (suave). Poner de nuevo en el soporte magnético y eliminar el sobrenadante.
• Añadir la mezcla antígeno-anticuerpo (primera parte) al eppendorf con las bolas magnéticas lavadas e incubar a temperatura ambiente 1 hora en agitación (rotación).
• Poner el eppendorf en el soporte magnético y eliminar el sobrenadante.
• Añadir 500 µl de IP Lysis/Wash buffer (con inhibidores de proteasas) y mezclar. Poner en el soporte magnético y eliminar el sobrenadante.
• Volver a repetir el lavado
• Añadir 500 µl de agua destilada ultrapura y mezclar. Poner en el soporte magnético y eliminar el sobrenadante.
• Añadir 100 µl de Lane Marker Sample Buffer (diluida 5x en agua destilada) al tubo y calentar a 96 – 100 ºC durante 10 minutos.
• Poner en el soporte magnético para que las bolas magnéticas se separen.
• Con el sobrenadante realizar la electroforesis en gel de acrilamida.

18.10.2018: Electroforesis gel acrilamida

• Preparar el gel de resolución al 10 % y gel de concentración al 4 %
• Carregar les mostres (40 µl de cada)
  

1. Laemmli
2. Marcador 
3. Transfectadas  (suero CNTN1+) AGAROSA
4. Transfectadas (suero CNTN1-) AGAROSA
5. No transfectadas (suero CNTN1+) AGAROSA
6. Laemmli
7. Transfectadas (suero CNTN1+) MAGNETIC BEADS
8. Transfectadas (suero CNTN1-) MAGNETIC BEADS
9. No transfectadas (suero CNTN1+) MAGNETIC BEADS
10. Laemmli

• Correr el gel a 20 mA
  
• Parar la electroforesis y lavar el gel con 2 veces con H₂Od
• Fijar durante 15 minutos
  • 50 % metanol (10 ml)
  • 10 % ácido acético (2 ml)
  • 40 % H₂Od (8 ml)
• Lavar 3 veces con H₂Od
• Teñir con Novex (de 3 a 12 horas a Tambiente en agitación)
  • 4 ml metanol
  • 1 ml Stainer B
  • 4 ml Stainer A
  • 11 ml  H₂Od
    
• Desteñir lavando con  H₂Od overnight a 4ºC (en agitación)

RESULTADO

A simple vista no se ven diferencias claras entre los pocillos con HEKs transfectadas tratadas con suero CNTN1+ y el resto de pocillos.

Entre los dos tipos de IP sí que hay diferencias –> en los pocillos de las meustras immunoprecipitadas con agarosa hay mucha más cantidad de proteína –> parece que la immunoprecipitación con magnetic beads sea más limpia. 

Hacer western blot con las mismas muestras para ver si se observa la CNTN1.

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