Dia 12.06.2018: Després de treure el nervi ciàtic del porc i netejar-lo, els grups de fibres nervioses s’han fixat en PFA 4 % , o en PFA 2 % (en placa de 12 wells). S’ha contabilitzat el temps que es triga en ser manipulat cada grup de fibres abans de posar-lo a fixar.
Els nervis s’han fixat durant 2 – 3 hores i després s’ha procedit a fer el teasing (s’han utilitzat 2 tipus de portaobjectes: comercials, i tractats al laboratori).
S’han deixat assecar a temperatura ambient, i després s’han transferit al congelador de -20ºC
Al dia següent: s’ha fet la IH per testar els teasings –> s’han agafat dos portaobjectes tractats al laboratori (PFA 4% i PFA 2 %) i dos portaobjectes comercials (PFA 4 % i PFA 2 %)
- Treure la mostra amb el teasing de ciàtic del congelador i posar-la de forma ràpida directament en acetona (-20ºC).
- 2 rentats de 5 min amb PBS1x (en agitació suau)
- Marcar amb rotulador (DakoPen) la localització de la mostra sense exercir excessiva pressió.
- Indicar en llapis en l’esmerilat del vidre el numero de mostra i la data de l’experiment
- Amb una pipeta Pasteur de plàstic cobrir la totalitat de la mostra amb la solució de bloqueig Goat sèrum al 5% . Incubar 1h a TA en cambra humida.
- A un dels costats s’ha posat tritó 0’3 % (diluït en goat 5 %)
- 2 rentats de 5 min amb PBS1x (en agitació suau)
- Incubar amb l’anticòs comercial primari Chicken anti-human/rat/mouse-NF (AF3235 d’R&D System)* 1/500 amb goat sèrum 5%.
- Afegir uns 200 mcL/mostra d’anticòs comercial diluït i incubar 1 h a TA en cambra humida.
- 2 rentats de 5 min amb PBS1x (en agitació suau)
- Incubar amb l’anticòs GAC488 (verd) 1/1000
- 2 rentats de 5 min amb PBS1x (en agitació suau)
- Eixugar la mostra amb tissues i eliminar al màxim l’excés de solució de bloqueig amb paper Whatman.
- Montar la preparació amb Fluoprep
Resultat: la millor condició és PFA 4 % amb portaobjectes comercials.
