IMMUNOPRECIPITACIÓN NEURONAS GDRs
Muestra: 17-595 (O’Nions Daniel, Royal London Hospital)
1r DIA
Enfriar la centrífuga pequeña a 4ºC. Poner 5 eppendorfs, PBS y 15 mL de buffer de lisis en hielo. Trabajar siempre en frío.
- Incubar el cultivo de neuronas con el suero del paciente a analizar 1h a 37ºC (en el incubador). La dilución se hace en el propio medio de cultivo NG. La dilución se hace en la misma placa de cultivo (sacar el medio hasta dejar 3 ml por placa, y poner el suero)
- Para IgG: 1/100 –> 30 µl de suero en 3 ml de medio
- Para IgM: 1/40 –> 75 µl de suero en 3 ml de medio
- Cuando queden 5 min, preparar la mezcla Buffer de lisis (nevera entrada) + inhibidores de proteasas (caja de cartón, cajón Fina -20ºC) 1/100. Preparar 5 mL: 50 µL IP+ 5 mL BL.
- Lavar las placas 2 veces con PBS atemperado, vaciar y añadir 800 µl de buffer lisis + inhibidores de proteasas 1/100 a cada placa. Dejar en agitación fuerte (fijadas con cinta) durante 1h a 4ºC.
- En este intervalo de tiempo, hacer el lavado de la proteína A+G (INVITROGEN Cat:15920-010. y cat:15918-014). Preparar la Proteína A+G:
- a) Resuspender las bolas con agitación manual (no vórtex ni inversión)
- b) En un eppendorf por cada suero a analizar, añadir con punta de pipeta cortada 50 µl de proteína G + 50 µl de proteína A + 800 µl de buffer lisis
- c) Lavar 2 veces con Buffer de lisis centrifugando a 1000 rpm 5min. a 4ºC. Repetir un último lavado adicional añadiendo inhibidores de proteasas en el último lavado (del BL+IP 1/100 sobrante del paso 2).
*No pipetear las bolas arriba y abajo para evitar que se enganchen a la punta lo máximo posible.
- Dentro de la cámara fría, pasar el scraper a cada una de las placas y recoger todo el volumen y restos celulares en un eppendorf por placa. Centrifugar 5 min a velocidad máxima a 4ºC.
- Pasar el sobrenadante de todos los eppendorfs a un tubo de 15ml. Añadir 500 µl de buffer lisis con las bolas de proteína A+G sin pipetear arriba y abajo.
- Dejar O/N (cuanto más rato mejor) en rotación a 4ºC tapando el tubo con Parafilm.
2º DIA
Enfriar la centrífuga grande y la pequeña a 4ºC.
- Preparar el gel de resolución de acrilamida al 12% (añadir 7,5 mL y enrasar con SDS 0.2% o isopropanol) y dejar polimerizar 40 min mínimo. Preparar el gel de concentración al 4%, poner pinza de 10 pocillos y dejar polimerizar 40 min. *Para hacer los geles utilizar aigua destilada estéril.
- Centrifugar el tubo de 15ml que dejamos en rotación con la proteína A+G a 3000 rpm 5 min a 4ºC.
- Descartar el sobrenadante con pipeta Pasteur de cristal (con xumet) y pasar el pellet con punta cortada a un eppendorf.
- Lavar el pellet 2 veces con 1 mL de lisis buffer. Centrifugar a 3000 rpm 5min a 4ºC después de cada lavado.
- Mientras preparar mezcla Laemmli + B-mercapto: 950 µL Laemmli+ 50 µL de B-mercapto (nevera)
- Descartar sobrenadante y añadir al pellet 40 µl de Laemmli + Mercapto. Homogeneizar dando suaves golpes al eppendorf. Dejar 5 min a Tºambiente
- Calentar a 100ºC 5min (en el baño seco). Al acabar, atemperar la muestra 2 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar 5 min al máximo y cargar los 40 µL de la muestra en un solo carril del gel (se carga la mayor cantidad de muestra que se pueda).
- Cargar a un carril de distancia el marcador (10 µl). En los carriles vacíos cargar Laemmli+ b-mercapto hasta medio pocillo.
- Correr unos 4 cms de gel y pararlo. Condiciones: 20 mA; constant A.
- Lavar el gel dos veces con H2O destilada.
- Fijar 15 min y lavar 3 veces con H2
- Teñir con NOVEX, mínimo 3h y máximo 12h en agitación suave.
- Desteñir lavando con H2O en agitación suave a 4ºC.ON
- Recortar las bandas y enviar para su posterior análisis identificativo.
SOLUCION DE FIJADO.
- 50% Metanol 10 mL
- 10% Acético 2 mL
- 40% H20 8 mL
NOVEX (Colloidal Blue Starning Kit INVITROGEN cat nºLC6025)
- Metanol 4 mL
- Stainer B 1 mL
- Stainer A 4 mL
- H2O 11 mL
BUFFER LISIS (4ºC)
- 1% Triton X100 en H2O 1 mL
- 150mM Nacl 0.87g; num 1
- 1mM EDTA 200 mcl de EDTA 0.5M
- 100mM Tris-HCL 20 mL de Tris 0.5M
- 0.5% Deoxycholate acid 0.5 g; num 141
- Agua dest qsp. 100 mL
Ajustar pH a 7,5 y filtrar.
RESULTADO: Se han enviado las bandas (día 16.03.18). Todavía no hay resultado
