20180226 – 20180228: Maxi ANO2

26.02.18: Transformació

Matí: Preparació de medi de cultiu i plaques

• LB:
  • 250 ml H₂0d + 6, 25 g de LB (num. 189) –> posar H₂0d a ampolla i posar-hi LB. Escalfar i barrejar amb mosca.
  • Autoclavar (treure la mosca abans) –> no tancar el tap del tot.
  • Deixar a Tambient
• LB + Agar (per les plaques):
  • 100 de medi LB à afegir 2 g d’Agar (num. 123)
  • Autoclavar à no tancar el tap del tot
  • Deixar refredar una mica i posar l’antibiòtic à en aquest cas es posa ampicil·lina 1/1000 perquè el plàsmid té resistència a ampicil·lina.

• Preparació de plaques: s’ha de fer amb el bunsen encès.
  • Afegir la solució de LB+agar+ampicil·lina a cada placa (decantant)
  • Deixar les plaques mig obertes fins que solidifiqui (posar un paper de filtre a sobre per evitar contaminació)
  • Guardar a 4ºC boca abaix (embolicat en parafilm i paper de plata)

Tarda: Transformació E.Coli –> Es segueix el protocol de Stratagene: XL10-Gold Ultracompetent cells.  Cat nº: 200314

• Posar en gel 3 tubs falcon de bacteris (amb doble tancament) à control positiu, control negatiu i ANO2 (plàsmid que utilitzarem).
• Descongelar les cèl·lules competents en gel (es troben a -80ºC)
• Treure del congelador (del kit) el βmercaptoetanol (tap verd) i el pUC18 (DNA del control positiu, tap blau).
• Afegir 100 µL de cèl·lules a cada tub
• Afegir 4 µL de βME a cada tub
• Incubar 10 minuts en gel i anar barrejant cada dos minuts (suaument).
• Afegir el DNA als tubs (cada DNA al tub corresponent):
  • pUC18 (control positiu): fer dilució 1/10 amb H2Od estèril i afegir 1 µL
  • ANO2: afegir 0’1 – 50 ng à el plàsmid original està a una concentració de 100 ng/µL. Per tant, afegir 0’5 µL (50 ng).
• Incubar 30 minuts en gel

*durant aquesta estona, escalfar l’agitador orbital (37ºC) i el bany humit (42ºC) –> preescalfar un tub de LB a 42ºC

• Posar els tubs 30 segons al bany humit a 42ºC (pas crític!!!)
• Posar en gel 2 minuts
• Afegir 0,8 ml de LB preescalfat a cada tub.
• Incubar 1 hora a 37ºC agitant a 225-250 rpm (agitador orbital)
• Plaquejar: posar a cada placa uns µL de la solució i escampar amb una nansa (pipeta Pasteur de vidre amb la punta tancada i doblegada amb el bunsen).
• En aquest cas, es fan 4 plaques (s’han d’atemperar una estona a Tambient):
  • Control positiu: 100 µL
  • Control negatiu: 100 µL
  • ANO2: 50 µL, 100 µL
• Incubar tota la nit a 37ºC (a l’estufa)

27.02.18: Starter

• A primera hora: picar algunes colònies per fer-les créixer à s’escullen 2 colònies que estiguin ben aïllades (encerclar amb rotulador).
• Amb una punta de pipeta mitjana agafar una colònia aïllada
• Posar-la a un tub falcon de bacteris amb 5 mL de LB + ampicil·lina 1/1000 à deixar anar la punta dins del tub i deixar-la allà.
  • Si el Starter es fa a partir d’un glicerolat à sense deixar que el glicerolat es descongeli (recollir del congelador en gel), deixar refredar la nansa de Kolle (escalfada al Bunsen per esterilitzar-la); raspar la mostra de glicerolat amb el bacteri transfectat d’interès i afegir dins el tub amb LB+antibiòtic.
• Deixar unes hores a 37ºC agitant a 225-250 rpm (agitador orbital)
• Preparar un Erlenmeyer de 150 mL de medi LB: 3.75 g LB+ 150 mL H2O. Autoclavar i deixar refredar. Afegir Ampicil·lina 1/1000
• A les 16:00 de la tarda abocar l’starter prèviament seleccionat en l’Erlenmeyer amb LB.
• Incubar overnight a 37 ºC en agitació (agitador orbital)

28.02.18: Maxiprep

A l’endemà,

1. A l’endemà, amb una part del cultiu continuar amb el protocol per a maxi-preps, i amb l’altra preparar un glicerolat:
   1. Preparar 3 mL d’una solució de glicerol al 50%. Nota: el glicerol comercial disponible és al 87%. Pipetejar 1.72 mL de glicerol al 87% i 1,28 mL d’aigua Braun. Homogeneïtzar i filtrar al costat del Bunsen.
   2. En un criotub rotulat, afegir 300 mcL de glicerol al 50% (tallar la punta lleugerament per a facilitar el seu pipeteig).
   3. Afegir 600 mcL de cultiu i barrejar. Congelar a -80ºC.

Maxi-Prep protocol 

1. Pellet 150 ml (high-copy plasmid) or 250 ml (low-copy plasmid) overnight LB culture at 6000 x g for 15 min at 4°C. Fer servir la ultracentrífuga amb tubs Beckman equilibrats per pes amb aigua
2. Discard the supernantant and resuspend the bacterial pellet homogeneously in 10 ml Buffer P1.
3. Add 10 ml Buffer P2, mix by inverting 4–6 times, and incubate at room temperature (15–25°C) for 5 min. If using LyseBlue reagent, the solution will turn blue.
4. During the incubation, screw the cap onto the outlet nozzle of the QIAfilter Cartridge. Place the QIAfilter Cartridge into a convenient tube or a QIArack (cat. no. 19015).
5. Add 10 ml prechilled Buffer P3, and mix thoroughly by inverting 4–6 times. If using LyseBlue reagent, mix the solution until it is completely colorless
6. Pour the lysate into the barrel of the QIAfilter Cartridge. Incubate at room temperature for 10 min. Do not insert the plunger!
7. Equilibrate a HiSpeed Tip with 10 ml Buffer QBT, allowing it to enter the resin.
8. Remove the cap from the QIAfilter Cartridge outlet nozzle. Gently insert the plunger into the QIAfilter Cartridge, and filter the cell lysate into the equilibrated HiSpeed Tip.
9. After the lysate has entered, wash the HiSpeed Tip with 60 ml Buffer QC.
10. Elute DNA with 15 ml Buffer QF.
11. Precipitate DNA by adding 10.5 ml isopropanol, mix, and incubate for 5 min.
12. During the incubation, remove the plunger from a 30 ml syringe and attach theQIAprecipitator Module onto the outlet nozzle.
13. Place the QIAprecipitator over a waste bottle, transfer the eluate– isopropanol mixture into the syringe, and insert the plunger. Filter the eluate–isopropanol mixture through the QIAprecipitator using constant pressure.
14. Remove the QIAprecipitator from the syringe and pull out the plunger. Reattach the QIAprecipitator and add 2 ml 70% ethanol to the syringe. Wash the DNA by inserting the plunger and pressing the ethanol through the QIAprecipitator.
15. Remove the QIAprecipitator from the syringe and pull out the plunger. Attach the QIAprecipitator again, insert the plunger, and dry the membrane by pressing air through the QIAprecipitator forcefully. Repeat this step several times.
16. Dry the outlet nozzle of the QIAprecipitator with adsorbent paper.
17. Remove the plunger from a new 5 ml syringe, attach the QIAprecipitator and hold the outlet over a 1.5 ml collection tube (criotube). Add 1 ml Buffer TE to the 5 ml syringe. Insert the plunger and elute the DNA into the collection tube using constant pressure.
18. Remove the QIAprecipitator from the 5 ml syringe, pull out the plunger and re-attach the QIAprecipitator to the 5 ml syringe.
19. Transfer the eluate from step 17 to the 5 ml syringe and elute for a second timeinto the same 1.5 ml tube.
20. Measure DNA concentration with Nanodrop. Use Buffer TE as blank solution.

RESULTS

CV2: 590 ng/mcL 260/280:1.81