20170612-14: maxi PIEZO1 (NParaneo Clínic) Xl10-Gold ultracompetent cells

Se repite la transformación  del día 07/06/2017  (conc  vector 2.9 ng/mcl) con células ultracompetentes  XL10-Gold ( 200314 Stratagene)

12/06/2017 TRANSFORMACIÓN E .COLI

1. A primera hora del matí preparar medi LB-Agar: a 100 mL de medi LB afegir 2 g d’agar i autoclavar. Quan estigui atemperat afegir  Ampi  1/1000 (100 mcl).
2. Plaquejar el medi a 20 mL medi/placa i posar les 5 plaques a l’inrevés a l’estufa de bacteris a 37º C.
3. Aprox a les 15h de la tarda atemperar el bany a 42 ºC i començar el protocol.
4. Pre-incubar les cèlules del kit XL10-Gold Ultracompetent cells ( 200314 Stratagene) amb 4 mcl B-mercaptoetanol en gel durant 10 min.
5. Afegir 25 mcL ( 72,5 ng)  del vector. Afegir el DNA sense pipetejar.
6. Incubar 30 min en gel.
7. Xoc tèrmic: posar el tub al bany a 42ºC durant 30 segons.
8. Posar els tubs en gel 2 minuts.
9. Afegir, sense pipetejar, 800 mcL de medi  LB al tub amb bacteris.
10. Deixar en agitació a 225 rpm i 37ºC durant 1 h.
11. Distribuir volums seriats ( 25, 50,100,150 i 200 mcL) a cadascuna de les plaques de LB+agar (que prèviament estaven a l’estufa a 37ºC) sense pipetejar (abocar-lo directament).
12. Extendre el volum amb una nansa de Digralsky feta amb una Pasteur de vidre.
13. Incubar ON a 37ºC en estufa de bacteris, posant les plaques cap per avall.

13/06/2017 STARTER

1. A l’endemà pel matí treure les plaques de l’estufa. Marcar varies colònies per placa que estiguin prou separades i que tinguin mide a poder ser petita, i tapant-les amb parafilm, posar-les a la nevera per evitar sobrecreixement.
2. Fer quatre starters amb 5 mL de medi LB (+ ampi 1/1000) per vector amb qatre colònies petites i localitzades.
3. Preparar dos  Erlenmeyers de 150 mL de medi LB: 3.75 g LB+ 150 mL H2O. Autoclavar i deixar refredar. Afegir ampi 1/1000.
4. A les 16: 00 de la tarda, al costat del Bunsen, abocar els  starters que més hagin crescut  dins els Erlenmeyers amb LB. Amb la resta d’ starters preparar un glicerolat. S’han escollit els starters  de les colònies número 1 i 2.
5. Incubar O/N a 37 ºC en agitació.

14/06/2017 MAXIPREP

1. A l’endemà, amb una part del cultiu continuar amb el protocol per a maxi-preps, i amb l’altra preparar un glicerolat de les colònies escollides per fer la maxi:
   1. Preparar 3 mL d’una solució de glicerol al 50%. Nota: el glicerol comercial disponible és al 87%. Pipetejar 1.72 mL de glicerol al 87% i 1,28 mL d’aigua Braun. Homogeneïtzar i filtrar al costat del Bunsen.
   2. En un criotub rotulat, afegir 300 mcL de glicerol al 50% (tallar la punta lleugerament per a facilitar el seu pipeteig).
   3. Afegir 600 mcL de cultiu i barrejar. Congelar a -80ºC.

Maxi-Prep protocol 

1. Pellet 150 ml (high-copy plasmid) or 250 ml (low-copy plasmid) overnight LB culture at 6000 x g for 15 min at 4°C. Fer servir la ultracentrífuga amb tubs Beckman equilibrats per pes amb aigua.

2. Discard the supernantant and resuspend the bacterial pellet homogeneously in 10 ml Buffer P1.

3. Add 10 ml Buffer P2, mix by inverting 4–6 times, and incubate at room temperature (15–25°C) for 5 min. If using LyseBlue reagent, the solution will turn blue.

4. During the incubation, screw the cap onto the outlet nozzle of the QIAfilter Cartridge. Place the QIAfilter Cartridge into a convenient tube or a QIArack (cat. no. 19015).

5. Add 10 ml prechilled Buffer P3, and mix thoroughly by inverting 4–6 times. If using LyseBlue reagent, mix the solution until it is completely colorless.

6. Pour the lysate into the barrel of the QIAfilter Cartridge. Incubate at room temperature for 10 min. Do not insert the plunger!

7. Equilibrate a HiSpeed Tip with 10 ml Buffer QBT, allowing it to enter the resin.
8. Remove the cap from the QIAfilter Cartridge outlet nozzle. Gently insert the plunger into the QIAfilter Cartridge, and filter the cell lysate into the equilibrated HiSpeed Tip.

9. After the lysate has entered, wash the HiSpeed Tip with 60 ml Buffer QC.
10. Elute DNA with 15 ml Buffer QF.
11. Precipitate DNA by adding 10.5 ml isopropanol, mix, and incubate for 5 min.
12. During the incubation, remove the plunger from a 30 ml syringe and attach theQIAprecipitator Module onto the outlet nozzle.

13. Place the QIAprecipitator over a waste bottle, transfer the eluate– isopropanol mixture into the syringe, and insert the plunger. Filter the eluate–isopropanol mixture through the QIAprecipitator using constant pressure.

14. Remove the QIAprecipitator from the syringe and pull out the plunger. Reattach the QIAprecipitator and add 2 ml 70% ethanol to the syringe. Wash the DNA by inserting the plunger and pressing the ethanol through the QIAprecipitator.

15. Remove the QIAprecipitator from the syringe and pull out the plunger. Attach the QIAprecipitator again, insert the plunger, and dry the membrane by pressing air through the QIAprecipitator forcefully. Repeat this step several times.

16. Dry the outlet nozzle of the QIAprecipitator with adsorbent paper.
17. Remove the plunger from a new 5 ml syringe, attach the QIAprecipitator and hold the outlet over a 1.5 ml collection tube (criotube). Add 1 ml Buffer TE to the 5 ml syringe. Insert the plunger and elute the DNA into the collection tube using constant pressure.

18. Remove the QIAprecipitator from the 5 ml syringe, pull out the plunger and re-attach the QIAprecipitator to the 5 ml syringe.

19. Transfer the eluate from step 17 to the 5 ml syringe and elute for a second timeinto the same 1.5 ml tube.

20. Measure DNA concentration with Nanodrop. Use Buffer TE as blank solution.

RESULTS

PIEZO1 (maxi colonia 1): 297,6 ng/mcL. 260/280:1.84

A pesar de repetir la elución en múltiples ocasiones, la maxi de la colonia 2 ha dado una concentración de 20.8 ng/mcL. En vista de estos resultados, se procede a deshechar dicha alícuota.