Se repite la transformación del día 31/05/2017 midiendo la cantidad de DNA con el Nanodrop y ajustando el volumen de la transformación en función del valor obtenido (conc 2.9 ng/mcl)
07/06/2017 TRANSFORMACIÓN E .COLI
- A primera hora del matí preparar medi LB-Agar: a 100 mL de medi LB afegir 2 g d’agar i autoclavar. Quan estigui “fred” afegir Ampi 1/1000 (100 mcl).
- Plaquejar el medi a 20 mL medi/placa i posar les plaques a l’inrevés a l’estufa de bacteris a 37º C. (Quan solidifiquin, si no es volen fer servir es poden guardar a la nevera).
Nota: se han aprovechado 2 placas de LB-agar con ampi 1/1000 preparadas el día 31/05/2017.
- Aprox a les 15h de la tarda atemperar el bany a 42 ºC i començar el protocol.
- En dos tubs de bacteris del kit One Shot TOP10 Chemically Competent E .coli, afegir respectivament 25 mcL ( 72,5 ng) del vector. Afegir el DNA sense pipetejar.
- Incubar 30 min en gel.
- Xoc tèrmic: posar el tub al bany a 42ºC durant 30 segons.
- Posar els tubs en gel 2 minuts.
- Afegir, sense pipetejar, 250 mcL de medi SOC (o alternativament LB) a cada tub.
- Deixar en agitació a 225 rpm i 37ºC durant 1 h.
- Distribuir volums seriats ( 100 i 150 mcL) de cada un dels tubs a dues plaques de LB+agar (que prèviament estaven a l’estufa a 37ºC) sense pipetejar (abocar-lo directament).
- Extendre el volum amb una nansa de Digralsky feta amb una Pasteur de vidre.
- Incubar ON a 37ºC en estufa de bacteris, posant les plaques cap per avall.
08/06/2017 STARTER
Nuevamente las células transformadas no han crecido a pesar de haber usado la conc. real del vector medida por Nanodrop. En futuros experimentos se repetirá la transformación utilizando “XL10-Gold Ultracompetent Cells” en vez de nuestras células competentes habituales.
