En vista de los resultados obtenidos en la IP de cél Schwann IgM del paciente JFGR (neuropatía paraneo del clínic), se pide al Dr. Coste (Marsella) una alícuota del vector de Piezo 1.
Nos llega en papel secante 10 mcl de la maxi 321.4 ng/ul del plásmido pcDNA3.1(-)-ires2-EGFP para Piezo 1, con resistencia a Ampi. Se recorta un pequeño fragmento, se mete en un eppendorf, se resuspende en 200 mcl agua Braun (conc. final teórica 16,07 ng/mcL), y se deja O/N en nevera.
31/05/2017 TRANSFORMACIÓN E .COLI
- A primera hora del matí preparar medi LB-Agar: a 100 mL de medi LB afegir 2 g d’agar i autoclavar. Quan estigui “fred” afegir Ampi 1/1000 (100 mcl).
- Plaquejar el medi a 20 mL medi/placa i posar les plaques a l’inrevés a l’estufa de bacteris a 37º C. (Quan solidifiquin, si no es volen fer servir es poden guardar a la nevera).
- Aprox a les 15h de la tarda atemperar el bany a 42 ºC i començar el protocol.
- En dos tubs de bacteris del kit One Shot TOP10 Chemically Competent E .coli, afegir respectivament 5 mcL (80,35 ng) del vector. Afegir el DNA sense pipetejar.
- Incubar 30 min en gel.
- Xoc tèrmic: posar els dos tubs al bany a 42ºC durant 30 segons.
- Posar els tubs en gel 2 minuts.
- Afegir, sense pipetejar, 250 mcL de medi SOC (o alternativament LB) a cada tub.
- Deixar en agitació a 225 rpm i 37ºC durant 1 h.
- Distribuir volums seriats (50, 100 i 150 mcL) de cada un dels tubs a tres plaques de LB+agar (que prèviament estaven a l’estufa a 37ºC) sense pipetejar (abocar-lo directament).
- Extendre el volum amb una nansa de Digralsky feta amb una Pasteur de vidre.
- Incubar ON a 37ºC en estufa de bacteris, posant les plaques cap per avall.
01/06/2017
Esta mañana no se ha observado crecimiento en ninguna de las placas. Se repetirá la transformación midiendo la cantidad de DNA con el Nanodrop y ajustando el volumen de la transformación en función del valor obtenido.
