INMUNOPRECIPITACION NEURONAS GRDs
Muestra IP : 03-838 (neuropatías paraneoplásicas Clínic), analizada por IgG.
PROTOCOLO
1º DIA
Enfriar la centrífuga pequeña a 4ºC. Poner 5 eppendorfs, PBS y 15 mL de buffer de lisis en hielo. Trabajar siempre en frío.
1) Incubar el cultivo de neuronas con el suero del paciente a analizar 1h a 37ºC.
Suero del paciente dil.(IgG1/100; IgM 1/40) en el propio medio de cultivo (IgG:30ul de suero/3ml medio; IgM: 75 mcL en 3 mL suero).
OJO! Hacer fuera la dilución de la muestra con 1 mL de medio por placa añadiendo 30×5 mcL de suero (para IgG, el volumen propio para IgM), dejando 2 mL por placa y luego añadiendo un mL de la dilución.
Inmunoprecipitar cels del cultivo neuronal pool de 5 placas de 100mm / paciente.
2) Cuando queden 5 min, preparar la mezcla Buffer de lisis (nevera entrada) + inhibidores de proteasas (caja de cartón, cajón Fina -20ºC) 1/100. Preparar 5 mL: 50 mcL IP+ 5 mL BL.
3) Lavar las placas X2 con PBS atemperado, vaciar y añadir 800ul de buffer lisis + inhibidores de proteases 1/100 a cada placa. Dejar en agitación fuerte (fijadas con cinta) durante 1h a 4ºC.
En este intervalo de tiempo, hacer el lavado de la proteína A+G (INVITROGEN Cat:15920-010. y cat:15918-014).Preparar la Proteína A+G:
OJO! No pipetear las bolas arriba y abajo para evitar que se enganchen a la punta lo máximo posible.
- a) Resuspender las bolas con agitación manual (no vórtex ni inversión)
- b) En un eppendorf por cada suero a analizar, añadir con punta de pipeta cortada 50ul de proteína G + 50ul de proteína A + 800ul de buffer lisis
- c) Lavar X2 con Buffer de lisis centrifugando a 1000 rpm 5min. a 4ºC. Repetir un último lavado adicional añadiendo inhibidores de proteases en el ultimo lavado (del BL+IP 1/100 sobrante del paso 2).
4) Dentro de la cámara fría, pasar el scraper a cada una de las placas y recoger todo el volumen y restos celulares en un eppendorf /placa.
Centrifugar 30 min.velocidad máxima a 4ºC.
5) Pasar a un tubo de 15ml el SN del lisado, apurando al máximo con una punta de 500 y otra de 200.Añadir los 500ul de buffer lisis con las bolas de proteína A+G sin pipetear arriba y abajo.
Dejar O/N (cuanto más rato mejor) en rotación a 4ºC tapándo el tubo con Parafilm.
2º DIA
Enfriar la centrífuga grande y la pequeña a 4ºC.
- Preparar el gel de resolución de acrilamida al 12% (añadir 7,5 mL y enrasar con SDS 0.2% o isopropanol) y dejar polimerizar 40 min mínimo. Preparar el gel de concentración al 4%, poner pinza de 10 pocillos y dejar polimerizar 40 min (ver recetas en carpesano).
- Preparar tampón carrera 1x. Stock 10x: 144g glicina, 25 g de Tris, 10 g de SDS, 1 L agua destilada.
- Calentar el baño seco a 100º C.
- Centrifugar el tubo de 15ml que dejamos en rotación con la proteína A+G. a 3000 rpm 5 min. a 4ºC. Mientras preparar 3 mL BL+IP : 30 mcL IP+3mL LB.
- Descartar el SN con Pasteur estéril y pasar el pellet con punta cortada a un Eppendorf. Lavar el pellet X2 con 1 mL (añadir en volúmenes pequeños para limpiar tubo y pipeta al máximo y evitar perder bolas) de lisis buffer +inhibidores de proteases, centrifugar a 3000 rpm 5min a 4ºC.
- Mientras preparar mezcla Laemmli + B-mercapto: 950 mcL Laemmli+ 50 mcL mercapto (nevera)
- Descartar sn y añadir al pellet 50ul de la mezclaLaemmli simple buffer (Bio Rad# 161-0737) + 2-Mercapto. Homegeneizar dando suaves golpes al eppendorf. Dejar 5min. a Tºambiente
- Calentar a 100ºC 5min (seco). Al acabar, atemperar la muestra 2 min a TA.
- Centrifugar 5min. al max. y cargar el maximo volumen de la muestra (35 mcL) en un solo carril del gel. NO tirar el volumen sobrante, se rotula y congela en la caja IP Fina a -20ºC.
- Cargar a un carril de distancia el marcador (12 mcL) Precision Plus Prot Marker (cajón Fina -20ºC). En los carriles vacíos cargar Laemmli+ b-mercapto hasta medio pocillo.
- Correr unos 4cms de gel y pararlo. Condiciones: 20 mA; constant A.
- Lavar el gel X2 con H2O destilada.
- Fijar 15 min y lavar x3 con H2O.
- Teñir con NOVEX, mínimo 3h y máximo 12h en agitación suave.
- Desteñir lavando con H2O en agitación suave a 4ºC.ON
- Recortar las bandas y enviar para su posterior análisis identificativo.
SOLUCIONES
A) SOLUCION DE FIJADO.
50% Metanol 10 mL
10% Acético 2 mL
40% H20 8 mL
Lavar X3 con H2O
B) NOVEX (Colloidal Blue Starning Kit INVITROGEN cat nºLC6025)
Staining Solution:
Metanol 4 mL
Stainer B 1 mL
Stainer A 4 mL
H2O 11 mL
C) BUFFER LISIS (4ºC)
1% Triton X100 en H2O 1 mL
150mM Nacl 0.87g; num 1
1mM EDTA 200 mcl de EDTA 0.5M
100mM Tris-HCL 20 mL de Tris 0.5M
0.5% Deoxycholate acid 0.5 g; num 141
Agua dest qsp. 100 mL
Ajustar pH a 7,5 y filtrar.
