Se analizan por neuronas de GDRs de rata (fijadas con PFA 4% y congeladas a -80ºC) por IgG e IgM algunas de las muestras positivas en los ensayos del dia 20161222 .
PACIENTES
1 ) HVH1 (IgG)
2) num 119 (16-134) (IgG)
3) Holanda 34 (15-040) (IgG)
4) EBC (CIDP) (IgM)
PROTOCOLO
PRIMARIO:
- Diluir los sueros a analizar 1/150 (para IgG) o 1/40 (para IgM) en Goat 5% en cada uno de los pocillos de placa de 12 donde haremos la inmuno (300 mcL de volumen). Mezclar bien con pipeta procurando no hacer espuma y colocar el cubre en el fondo del pocillo de una placa de 12 pocillos vigilando que quede bien cubierto. Incubar 1h a TA. Vaciar el pocillo lavar una vez con PBS 1X.
SEGUNDARIO:
- Eliminar el PBS y añadir 300 mcL de el secundario GAH 488 IgG o GAH 488 IgM 1:1500 en Goat serum al 5%. Incubar 1h a temperatura ambiente.
- Lavar cada cubre con H2O y montarlo sobre un porta con Vectashield.
RESULTADOS
A diferencia del ensayo del día 22 de diciembre (mismas muestras sin haber congelado las neuronas), en este experimento sólo se ve positividad para el control HVH1. Como consecuencia se concluye que el fijar y congelar las muestras influye negativamente en el outcome de la técnica.
